9 Antworten auf „Gebrauchsanweisung für "Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel"“

  1. Oh ja bit­te! Am bes­ten auch bald noch an einen digi­ta­len Health­Pass­port knüp­fen. Dann darf nur der das Haus ver­las­sen und am öffent­li­chen Leben teil­ha­ben, der sich vor­her zuhau­se getes­tet hat und kein posi­ti­ves Ergeb­nis hat. So leben wir alle sicher und zufrie­den. Aber sozia­le Abstän­de müs­sen wei­ter gel­ten! Die nächs­te Pan­de­mie kommt bestimmt!

    1. Also nach nähe­rer Betrach­tung ist die­se qRT-PCR Test ein rela­ti­ver Standardtest.
      Bei die­sem Test wird das N‑Gen von SARS-CoV‑2 mit­tels einem Pri­mer­paar ampli­fi­ziert. Als Posi­tiv­kon­trol­le für die gesam­te PCR dient das Pri­mer­paar, wel­ches die mRNA für die mensch­li­che RNa­se P ampli­fi­ziert. Als wei­te­re Posi­tiv­kon­trol­le wer­den zwei wähl­ba­re Pro­ben emp­foh­len, die Nukle­in­säu­re von SARS-CoV‑2 ent­hal­ten. Mir ist nur nicht ganz klar, ob die SARS-CoV‑2 Posi­tiv­kon­trol­le RNA ent­hält oder bereits umge­schrie­be­ne cDNA. Wahr­schein­lich cDNA, da die­se sta­bi­ler als RNA ist.
      Auf Sei­te 37 kön­nen sie das Test­ergeb­nis sehen. Die grü­ne Linie mar­kiert den Schwel­len­wert. Wird der Schwel­len­wert über­schrit­ten, dann spuckt die Soft­ware für Pro­be XY den CT-Wert an, bei dem der Schwel­len­wert erreicht wur­de. In der Abbil­dung sind 7 Kur­ven nah zusam­men, neh­men wir davon den ers­ten als Bei­spiel: Hier wird der Schwel­len­wert bei Zyklus­zahl 23 über­schrit­ten. Hier wäre der CT-Wert für die­se Pro­be also 23. Für die letz­te der sie­ben Kur­ven wäre es die 28.
      Bei einer qRT-PCR ist es tat­säch­lich Stan­dard eine Zyklen­zahl von 40 durch­lau­fen zulas­sen. Der eigent­li­che Grund ist fol­gen­der: In der For­schung eig­net sich eine qRT-PCR super, um unter­schied­li­che Gen­ex­pres­sio­nen zu mes­sen. Gen­ex­pres­si­on bedeu­tet, wie häu­fig ein Gen abge­le­sen wird. Nicht alle Gene sind bei uns gleich aktiv und auch nicht zu jeder Zeit. Es hängt vom Ent­wick­lungs­sta­tus ab und Umwelt­fak­to­ren. Neh­men wir ein Bei­spiel: das Gen, wel­ches Lak­ta­se (ein Enzym, wel­ches Milch­zu­cker spal­tet) codiert, wird nur dann abge­le­sen, wenn sie auch Milch­zu­cker zu sich genom­men haben. Wenn man jetzt eine qRT-PCR machen wür­de und ent­nimmt Pro­ben vor und nach der Ein­nah­me von Milch­zu­cker, dann wür­de man bei der Pro­be vor Ein­nah­me einen CT-Wert von viel­leicht 38 oder 40, oder gar kei­nen Wert erhal­ten. Erhält man näm­lich gar kei­nen Wert, ist das näm­lich ein Pro­blem bei einer ver­glei­chen­den PCR. War­um? Das sehen wir gleich. Nach der Ein­nah­me von Milch­zu­cker wird das Gen für Lak­ta­se extrem hoch abge­le­sen, sodass der CT-Wert nach viel­leicht nur 15 Zyklen erreicht wird. Die­se Wer­te kön­nen sie in eine schi­cke For­mel packen und eine Gra­fik bas­teln, in der sie dar­stel­len, dass nach der Ein­nah­me von Milch­zu­cker die Gen­ex­pres­si­on zum Bei­spiel um 40 erhöht ist, als ohne Ein­nah­me von Milch­zu­cker. Erhal­ten sie kei­nen CT-Wert für die Pro­be vor Ein­nah­me von Milch­zu­cker, dann kön­nen sie auch die Ergeb­nis­se nicht in Rela­ti­on set­zen. Sie haben einen Wert von 15 und kei­nen mess­ba­ren Wert. Also kön­nen sie auch nicht sagen, dass das Gen 40 mal mehr abge­le­sen wird. Des­we­gen ist die Zyklen­zahl so hoch, sodass man auch die aller­kleins­ten Men­gen noch ampli­fi­zie­ren kann. Die meis­ten Gene wer­den tat­säch­lich immer ein klei­nes biss­chen abge­le­sen, sodass sie mRNA fin­den können.
      Kom­men wir zurück zu dem CDC-Manu­al. Auf der Sei­te 37 wird auch ange­ge­ben, wann ein Test posi­tiv ist. Grob kann man zusam­men­fas­sen, sobald der Schwel­len­wert erreicht wur­de inner­halb der 40 Zyklen gilt er als posi­tiv. Das ist hei­kel, denn der Test wird poli­tisch genutzt. Abge­stor­be­ne Viren geben eben­falls ein posi­ti­ves Testergebnis.
      Auf Sei­te 45 geht es um die Spe­zi­fi­tät des Pri­mer­paa­res, wel­ches das N‑Gen ampli­fi­zie­ren soll. Hier haben sie unter­schied­li­che Viren mit dem Pri­mer­paar unter­sucht und konn­ten kein PCR-Pro­dukt nach­wei­sen. Das ist schon mal gut. Lei­der wird aber nir­gend­wo in dem Manu­al die genaue Pri­mer­se­quenz ange­ge­ben, sodass man über­prü­fen könn­te, ob wirk­lich das N‑Gen ampli­fi­ziert wird und vor allem wo genau in dem Gen. Man ampli­fi­ziert näm­lich nie gan­ze Gene, son­dern nur Bruchstücke.
      Auf Sei­te 47 sehen sie ein inter­es­san­tes Ergeb­nis vom CDC sel­ber. Micha­el hat es rich­tig gese­hen. Von 2071 Pro­ben, die auch noch alle unter­schied­lich ent­nom­men wur­den, waren nur 49 posi­tiv. Und 17 von den 49 waren nach dem Sequen­zie­ren der PCR-Pro­duk­te tat­säch­lich posi­tiv. Das zeigt, dass die Pri­mer irgend­was in 32 Pro­ben ampli­fi­ziert haben. Wahr­schein­lich hat­ten die­se 32 Pro­ben auch einen hohen CT-Wert.
      Kur­zes Fazit: Für die For­schung scheint der Test ok zu sein. Es wäre nur gut, wenn auch die Pri­mer­se­quen­zen ange­ge­ben wer­den. Für die Dia­gnos­tik ist die­ser Test nicht sinn­voll. Es wird näm­lich nur ein Gen über­prüft und nicht meh­re­re. Viel­leicht wäre auch eine Kom­bi­na­ti­on aus PCR und Anti­kör­per-Test sinn­voll, aber das geht über mei­ne Kennt­nis­se hinaus.
      Ich hof­fe, dass ich ihnen hier­mit hel­fen konnte.

  2. Inter­es­sant ist die Klar­heit, mit der die Aus­sa­ge­fä­hig­kei der PCR-Tests in die­sem Doku­ment ver­neint bzw. rela­ti­viert wird: Das US-Ame­ri­ka­ni­sche CDC for­mu­liert in sei­nen Vor­ga­ben (10) für die Inter­pre­ta­ti­on des PCR-Tests das Fol­gen­de: „Detec­tion of viral RNA may not indi­ca­te the pre­sence of infec­tious virus or that 2019-nCoV is the cau­sa­ti­ve agent for cli­ni­cal sym­ptoms“ (Über­set­zung: „Der Nach­weis von vira­ler RNA weist mög­li­cher­wei­se nicht auf das Vor­han­den­sein eines infek­tiö­sen Virus oder dar­auf hin, dass 2019-nCoV der Aus­lö­ser für kli­ni­sche Sym­pto­me ist.“).
    Die ist "Sta­te of the Art" seit Ent­wi­ckung der PCR-Metho­de. Wei­te­re Infos hier:
    Quel­le: https://​lauf​pass​.com/​g​e​s​e​l​l​s​c​h​a​f​t​/​d​a​s​-​e​v​i​d​e​n​z​-​f​i​a​s​ko/

  3. Erwäh­nens­wert ist jeden­falls die Aus­sa­ge auf Sei­te 42:
    "Sin­ce no quan­ti­fied virus iso­la­tes of the 2019-nCoV were available for CDC use at the time the test[…]"

    In einer frü­he­ren Ver­si­on hieß es: "Sin­ce no
    quan­ti­fied virus iso­la­tes of the 2019-nCoV are curr­ent­ly available".

    Ein Iso­lat ist zwar immer noch nicht ver­füg­bar, aber die For­mu­lie­rung umgeht nun die­sen Umstand.

  4. Die Fra­ge kann man im win­zi­gen Kom­men­tar­feld eigent­lich nicht beant­wor­ten. Den­noch: Soweit ver­stan­den, wer­den dort die Test­kits unter­schied­li­cher Her­stel­ler in ihrer Ver­läss­lich­keit unter­sucht und Hand­lungs­an­wei­sun­gen für die Benut­zung auf die­ser Basis verfasst.

    Bemer­kens­wert 2 Fundstellen:

    1. Sei­te 42 – Limit of Detec­tion (Intro)
    "LoD-Stu­di­en bestim­men die nied­rigs­te nach­weis­ba­re Kon­zen­tra­ti­on von 2019-nCoV, bei der etwa 95 % aller (echt posi­ti­ven) Repli­ka­te posi­tiv tes­ten. Die LoD wur­de durch Stu­di­en zur begrenz­ten Ver­dün­nung mit cha­rak­te­ri­sier­ten Pro­ben bestimmt.
    Die ana­ly­ti­sche Emp­find­lich­keit der rRT-PCR-Assays, die im CDC 2019 Novel Coro­na­vi­rus (2019- nCoV) Real-Time RT-PCR Dia­gno­stic Panel ent­hal­te­nen rRT-PCR-Assays wur­de in Limit of Detec­tion-Stu­di­en bestimmt.
    ***Da zum Zeit­punkt der Ent­wick­lung des Tests und der Durch­füh­rung die­ser Stu­die kei­ne quan­ti­fi­zier­ten Virus­iso­la­te des 2019-nCoV für die CDC zur Ver­fü­gung standen***,
    wur­den Assays, die für den Nach­weis der 2019-nCoV-RNA ent­wi­ckelt wur­den, mit Da zum Zeit­punkt der Ent­wick­lung des Tests und der Durch­füh­rung die­ser Stu­die kei­ne quan­ti­fi­zier­ten Virus­iso­la­te des 2019-nCoV für die CDC zur Ver­fü­gung stan­den, wur­den und die­se Stu­die durch­ge­führt wur­de, wur­den Assays, die für den Nach­weis der 2019-nCoV-RNA ent­wi­ckelt wur­den, mit cha­rak­te­ri­sier­ten Bestän­den von in vitro tran­skri­bier­ter Voll­län­gen-RNA (N‑Gen; Gen­Bank-Zugang: MN908947.2) mit bekann­tem Titer (RNA-Kopien/µL) getes­tet, die in ein Ver­dün­nungs­mit­tel bestehend aus einer Sus­pen­si­on von huma­nen A549-Zel­len und vira­len Trans­port­me­di­ums (VTM),
    ***um kli­ni­sche Pro­ben zu imitieren***.
    Die Extrak­ti­on der Pro­ben erfolg­te mit [hier folgt die Auf­zäh­lung der geprüf­ten Test­kits, nach­fol­gend die Metho­de der Prü­fung durch das CDC:]
    "Ein vor­läu­fi­ger LoD für jeden Assay wur­de bestimmt, indem drei­fa­che Pro­ben der mit jeder Extrak­ti­ons­me­tho­de gerei­nig­ten RNA getes­tet wur­den. Extrak­ti­ons­me­tho­de auf­ge­rei­nigt wur­den. Der unge­fäh­re LoD wur­de durch Extrak­ti­on und Tes­ten von 10-fachen Ver­dün­nungs­rei­hen von cha­rak­te­ri­sier­ten Bestän­den von in vitro tran­skri­bier­ter RNA in vol­ler Län­ge. Eine Bestä­ti­gung der LoD wur­de bestimmt wur­de durch die Ver­wen­dung von RNA-Pro­ben in 3‑facher Ver­dün­nungs­se­rie mit 20 extra­hier­ten Repli­ka­ten ermit­telt. Der LoD wur­de bestimmt als die nied­rigs­te Kon­zen­tra­ti­on, bei der ≥ 95% (19/20) der Repli­ka­te posi­tiv waren."

    2. Sei­te 39 – Limitations

    "Alle Benut­zer, Ana­ly­ti­ker und alle Per­so­nen, die Dia­gno­se­er­geb­nis­se mel­den, soll­ten in der Durch­füh­rung die­ses Ver­fah­ren durch einen kom­pe­ten­ten Aus­bil­der geschult wer­den. Sie soll­ten ihre Fähig­keit zur Durch­füh­rung des Tests demons­trie­ren und die Ergeb­nis­se zu inter­pre­tie­ren, bevor sie den Assay eigen­stän­dig durchführen.
    ***- Die Leis­tung des CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Dia­gno­stic Panel zeigt sich nur in Pro­ben der obe­ren und unte­ren Atem­we­ge (wie z. B. nas­opha­ryn­gea­le oder oro­pha­ryn­gea­le Abstri­che, Spu­tum, Aspi­ra­te der unte­ren Atem­we­ge, bron­cho­alveo­lä­re Lava­ge und nas­opha­ryn­gea­le nas­opha­ryn­gea­lem Wasch-/Aspi­rat oder nasa­lem Aspirat).***
    – Nega­ti­ve Ergeb­nis­se schlie­ßen eine 2019-nCoV-Infek­ti­on nicht aus und soll­ten nicht als allei­ni­ge Grund­la­ge für für die Behand­lung oder ande­re Ent­schei­dun­gen zum Pati­en­ten­ma­nage­ment ver­wen­det werden.
    ***Opti­ma­le Pro­ben­ty­pen und Zeit­punkt für Virus­spit­zen­wer­te bei durch 2019-nCoV ver­ur­sach­ten Infek­tio­nen sind noch nicht ermit­telt worden.***
    Ent­nah­me von Pro­ben (Typen und Zeit­punk­te) von ein und dem­sel­ben Pati­en­ten kann not­wen­dig sein, um das Virus nachzuweisen.
    – Ein falsch-nega­ti­ves Ergeb­nis kann auf­tre­ten, wenn eine Probe
    *** unsach­ge­mäß ent­nom­men, trans­por­tiert oder behan­delt wird.*** Falsch-nega­ti­ve Ergeb­nis­se kön­nen auch auf­tre­ten, wenn Ampli­fi­ka­ti­ons­in­hi­bi­to­ren in der Pro­be vor­han­den sind oder wenn eine unzu­rei­chen­de Anzahl von Orga­nis­men in der Pro­be vor­han­den ist.
    !!!***- Posi­ti­ve und nega­ti­ve prä­dik­ti­ve Wer­te sind stark von der Prä­va­lenz abhän­gig. Falsch-nega­ti­ve Test­ergeb­nis­se sind wahr­schein­li­cher, wenn die Prä­va­lenz der Krank­heit hoch ist. Falsch-posi­ti­ve Test­ergeb­nis­se bei nied­ri­ger Prävalenz.***
    – Ein falsch-nega­ti­ves Ergeb­nis kann auf­tre­ten, wenn eine Pro­be unsach­ge­mäß ent­nom­men, trans­por­tiert oder behan­delt wird. Falsch-nega­ti­ve Ergeb­nis­se kön­nen auch auf­tre­ten, wenn Ampli­fi­ka­ti­ons­in­hi­bi­to­ren in der Pro­be vor­han­den sind oder
    ***wenn eine unzu­rei­chen­de Anzahl von Orga­nis­men in der Pro­be vor­han­den ist.***
    – Posi­ti­ve und nega­ti­ve prä­dik­ti­ve Wer­te sind stark von der Prä­va­lenz abhän­gig. Falsch-nega­ti­ve Test­ergeb­nis­se Ergeb­nis­se sind wahr­schein­li­cher, wenn die Prä­va­lenz der Krank­heit hoch ist. Falsch-posi­ti­ve Test­ergeb­nis­se sind wahr­schein­li­cher, wenn die Prä­va­lenz mäßig bis gering ist.
    – Ver­wen­den Sie kei­ne Reagen­zi­en nach Ablauf des Verfallsdatums.
    – Wenn das Virus in der rRT-PCR-Ziel­re­gi­on mutiert, wird 2019-nCoV mög­li­cher­wei­se nicht oder weni­ger vor­her­sag­bar nach­ge­wie­sen wer­den. Inhi­bi­to­ren oder ande­re Arten von Inter­fe­ren­zen kön­nen zu einem falsch-nega­ti­ven Ergeb­nis füh­ren. Eine Inter­fe­renz­stu­die zur Bewer­tung der Wir­kung von Erkäl­tungs­me­di­ka­men­ten wur­de nicht wur­de nicht durchgeführt.
    – Die Test­leis­tung kann beein­träch­tigt wer­den, weil die Epi­de­mio­lo­gie und das kli­ni­sche Spek­trum der durch 2019-nCoV ver­ur­sach­ten Infek­ti­on nicht voll­stän­dig bekannt sind. Bei­spiels­wei­se wis­sen Kli­ni­ker und Labo­re mög­li­cher­wei­se nicht, wel­che Arten von Pro­ben opti­mal zu ent­neh­men sind und wann die­se Pro­ben im Ver­lauf der Infek­ti­on am ehes­ten Men­gen an vira­ler RNA ent­hal­ten, die leicht nach­ge­wie­sen wer­den können.
    !!!***- Der Nach­weis von vira­ler RNA muss nicht unbe­dingt auf das Vor­han­den­sein eines infek­tiö­sen Virus hin­wei­sen oder dar­auf, dass 2019-nCoV der Erre­ger der kli­ni­schen Sym­pto­me ist.***
    ***- Die Leis­tungs­fä­hig­keit die­ses Tests wur­de nicht für die Über­wa­chung der Behand­lung einer 2019-nCoV Infektion.***
    ***- Die Leis­tung die­ses Tests wur­de nicht für das Scree­ning von Blut oder Blut­pro­duk­ten auf das Vor­han­den­sein von 2019-nCoV.***
    ***- Die­ser Test kann Krank­hei­ten, die durch ande­re bak­te­ri­el­le oder vira­le Erre­ger ver­ur­sacht wer­den, nicht ausschließen. ***

    *** = durch mich als Mar­kie­rung verwendet.
    Über­set­zung mit deepL

    Mar­kant sind m.E. die mas­si­ven Unsi­cher­hei­ten. Begin­nend damit, dass man "etwas" sucht, von dem man meint, es wäre dem Virus ähn­lich (das man nicht kennt), wer­den Prü­fun­gen vor­ge­nom­men. Der Dis­clai­mer unter 2. ver­weist dar­auf, was dabei alles schief­ge­hen kann. Rich­tig auch der Hin­weis auf die Bedeu­tung der Prä­va­lenz für die Aus­sa­ge­kraft und vor allem die Tat­sa­che, dass der "Nach­weis von vira­ler RNA muss nicht unbe­dingt auf das Vor­han­den­sein eines infek­tiö­sen Virus hin­wei­sen oder dar­auf, dass 2019-nCoV der Erre­ger der kli­ni­schen Sym­pto­me ist.". 

    Also das, was Yea­den, Käm­me­rer, Füll­mich, Wodarg etc. schon die gan­ze Zeit AUCH sagen.

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