9 Antworten auf „Gebrauchsanweisung für "Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel"“

  1. Oh ja bit­te! Am besten auch bald noch an einen digi­ta­len HealthPassport knüp­fen. Dann darf nur der das Haus ver­las­sen und am öffent­li­chen Leben teil­ha­ben, der sich vor­her zuhau­se gete­stet hat und kein posi­ti­ves Ergebnis hat. So leben wir alle sicher und zufrie­den. Aber sozia­le Abstände müs­sen wei­ter gel­ten! Die näch­ste Pandemie kommt bestimmt!

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    1. Also nach nähe­rer Betrachtung ist die­se qRT-PCR Test ein rela­ti­ver Standardtest.
      Bei die­sem Test wird das N‑Gen von SARS-CoV‑2 mit­tels einem Primerpaar ampli­fi­ziert. Als Positivkontrolle für die gesam­te PCR dient das Primerpaar, wel­ches die mRNA für die mensch­li­che RNase P ampli­fi­ziert. Als wei­te­re Positivkontrolle wer­den zwei wähl­ba­re Proben emp­foh­len, die Nukleinsäure von SARS-CoV‑2 ent­hal­ten. Mir ist nur nicht ganz klar, ob die SARS-CoV‑2 Positivkontrolle RNA ent­hält oder bereits umge­schrie­be­ne cDNA. Wahrscheinlich cDNA, da die­se sta­bi­ler als RNA ist.
      Auf Seite 37 kön­nen sie das Testergebnis sehen. Die grü­ne Linie mar­kiert den Schwellenwert. Wird der Schwellenwert über­schrit­ten, dann spuckt die Software für Probe XY den CT-Wert an, bei dem der Schwellenwert erreicht wur­de. In der Abbildung sind 7 Kurven nah zusam­men, neh­men wir davon den ersten als Beispiel: Hier wird der Schwellenwert bei Zykluszahl 23 über­schrit­ten. Hier wäre der CT-Wert für die­se Probe also 23. Für die letz­te der sie­ben Kurven wäre es die 28.
      Bei einer qRT-PCR ist es tat­säch­lich Standard eine Zyklenzahl von 40 durch­lau­fen zulas­sen. Der eigent­li­che Grund ist fol­gen­der: In der Forschung eig­net sich eine qRT-PCR super, um unter­schied­li­che Genexpressionen zu mes­sen. Genexpression bedeu­tet, wie häu­fig ein Gen abge­le­sen wird. Nicht alle Gene sind bei uns gleich aktiv und auch nicht zu jeder Zeit. Es hängt vom Entwicklungsstatus ab und Umweltfaktoren. Nehmen wir ein Beispiel: das Gen, wel­ches Laktase (ein Enzym, wel­ches Milchzucker spal­tet) codiert, wird nur dann abge­le­sen, wenn sie auch Milchzucker zu sich genom­men haben. Wenn man jetzt eine qRT-PCR machen wür­de und ent­nimmt Proben vor und nach der Einnahme von Milchzucker, dann wür­de man bei der Probe vor Einnahme einen CT-Wert von viel­leicht 38 oder 40, oder gar kei­nen Wert erhal­ten. Erhält man näm­lich gar kei­nen Wert, ist das näm­lich ein Problem bei einer ver­glei­chen­den PCR. Warum? Das sehen wir gleich. Nach der Einnahme von Milchzucker wird das Gen für Laktase extrem hoch abge­le­sen, sodass der CT-Wert nach viel­leicht nur 15 Zyklen erreicht wird. Diese Werte kön­nen sie in eine schicke Formel packen und eine Grafik basteln, in der sie dar­stel­len, dass nach der Einnahme von Milchzucker die Genexpression zum Beispiel um 40 erhöht ist, als ohne Einnahme von Milchzucker. Erhalten sie kei­nen CT-Wert für die Probe vor Einnahme von Milchzucker, dann kön­nen sie auch die Ergebnisse nicht in Relation set­zen. Sie haben einen Wert von 15 und kei­nen mess­ba­ren Wert. Also kön­nen sie auch nicht sagen, dass das Gen 40 mal mehr abge­le­sen wird. Deswegen ist die Zyklenzahl so hoch, sodass man auch die aller­klein­sten Mengen noch ampli­fi­zie­ren kann. Die mei­sten Gene wer­den tat­säch­lich immer ein klei­nes biss­chen abge­le­sen, sodass sie mRNA fin­den können.
      Kommen wir zurück zu dem CDC-Manual. Auf der Seite 37 wird auch ange­ge­ben, wann ein Test posi­tiv ist. Grob kann man zusam­men­fas­sen, sobald der Schwellenwert erreicht wur­de inner­halb der 40 Zyklen gilt er als posi­tiv. Das ist hei­kel, denn der Test wird poli­tisch genutzt. Abgestorbene Viren geben eben­falls ein posi­ti­ves Testergebnis.
      Auf Seite 45 geht es um die Spezifität des Primerpaares, wel­ches das N‑Gen ampli­fi­zie­ren soll. Hier haben sie unter­schied­li­che Viren mit dem Primerpaar unter­sucht und konn­ten kein PCR-Produkt nach­wei­sen. Das ist schon mal gut. Leider wird aber nir­gend­wo in dem Manual die genaue Primersequenz ange­ge­ben, sodass man über­prü­fen könn­te, ob wirk­lich das N‑Gen ampli­fi­ziert wird und vor allem wo genau in dem Gen. Man ampli­fi­ziert näm­lich nie gan­ze Gene, son­dern nur Bruchstücke.
      Auf Seite 47 sehen sie ein inter­es­san­tes Ergebnis vom CDC sel­ber. Michael hat es rich­tig gese­hen. Von 2071 Proben, die auch noch alle unter­schied­lich ent­nom­men wur­den, waren nur 49 posi­tiv. Und 17 von den 49 waren nach dem Sequenzieren der PCR-Produkte tat­säch­lich posi­tiv. Das zeigt, dass die Primer irgend­was in 32 Proben ampli­fi­ziert haben. Wahrscheinlich hat­ten die­se 32 Proben auch einen hohen CT-Wert.
      Kurzes Fazit: Für die Forschung scheint der Test ok zu sein. Es wäre nur gut, wenn auch die Primersequenzen ange­ge­ben wer­den. Für die Diagnostik ist die­ser Test nicht sinn­voll. Es wird näm­lich nur ein Gen über­prüft und nicht meh­re­re. Vielleicht wäre auch eine Kombination aus PCR und Antikörper-Test sinn­voll, aber das geht über mei­ne Kenntnisse hinaus.
      Ich hof­fe, dass ich ihnen hier­mit hel­fen konnte.

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  3. Interessant ist die Klarheit, mit der die Aussagefähigkei der PCR-Tests in die­sem Dokument ver­neint bzw. rela­ti­viert wird: Das US-Amerikanische CDC for­mu­liert in sei­nen Vorgaben (10) für die Interpretation des PCR-Tests das Folgende: „Detection of viral RNA may not indi­ca­te the pre­sence of infec­tious virus or that 2019-nCoV is the cau­sa­ti­ve agent for cli­ni­cal sym­ptoms“ (Übersetzung: „Der Nachweis von vira­ler RNA weist mög­li­cher­wei­se nicht auf das Vorhandensein eines infek­tiö­sen Virus oder dar­auf hin, dass 2019-nCoV der Auslöser für kli­ni­sche Symptome ist.“).
    Die ist "State of the Art" seit Entwickung der PCR-Methode. Weitere Infos hier:
    Quelle: https://​lauf​pass​.com/​g​e​s​e​l​l​s​c​h​a​f​t​/​d​a​s​-​e​v​i​d​e​n​z​-​f​i​a​s​ko/

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  4. Erwähnenswert ist jeden­falls die Aussage auf Seite 42:
    "Since no quan­ti­fi­ed virus iso­la­tes of the 2019-nCoV were available for CDC use at the time the test[…]"

    In einer frü­he­ren Version hieß es: "Since no
    quan­ti­fi­ed virus iso­la­tes of the 2019-nCoV are curr­ent­ly available".

    Ein Isolat ist zwar immer noch nicht ver­füg­bar, aber die Formulierung umgeht nun die­sen Umstand.

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  5. Die Frage kann man im win­zi­gen Kommentarfeld eigent­lich nicht beant­wor­ten. Dennoch: Soweit ver­stan­den, wer­den dort die Testkits unter­schied­li­cher Hersteller in ihrer Verlässlichkeit unter­sucht und Handlungsanweisungen für die Benutzung auf die­ser Basis verfasst.

    Bemerkenswert 2 Fundstellen:

    1. Seite 42 – Limit of Detection (Intro)
    "LoD-Studien bestim­men die nied­rig­ste nach­weis­ba­re Konzentration von 2019-nCoV, bei der etwa 95 % aller (echt posi­ti­ven) Replikate posi­tiv testen. Die LoD wur­de durch Studien zur begrenz­ten Verdünnung mit cha­rak­te­ri­sier­ten Proben bestimmt.
    Die ana­ly­ti­sche Empfindlichkeit der rRT-PCR-Assays, die im CDC 2019 Novel Coronavirus (2019- nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel ent­hal­te­nen rRT-PCR-Assays wur­de in Limit of Detection-Studien bestimmt.
    ***Da zum Zeitpunkt der Entwicklung des Tests und der Durchführung die­ser Studie kei­ne quan­ti­fi­zier­ten Virusisolate des 2019-nCoV für die CDC zur Verfügung standen***,
    wur­den Assays, die für den Nachweis der 2019-nCoV-RNA ent­wickelt wur­den, mit Da zum Zeitpunkt der Entwicklung des Tests und der Durchführung die­ser Studie kei­ne quan­ti­fi­zier­ten Virusisolate des 2019-nCoV für die CDC zur Verfügung stan­den, wur­den und die­se Studie durch­ge­führt wur­de, wur­den Assays, die für den Nachweis der 2019-nCoV-RNA ent­wickelt wur­den, mit cha­rak­te­ri­sier­ten Beständen von in vitro tran­skri­bier­ter Volllängen-RNA (N‑Gen; GenBank-Zugang: MN908947.2) mit bekann­tem Titer (RNA-Kopien/µL) gete­stet, die in ein Verdünnungsmittel bestehend aus einer Suspension von huma­nen A549-Zellen und vira­len Transportmediums (VTM),
    ***um kli­ni­sche Proben zu imitieren***.
    Die Extraktion der Proben erfolg­te mit [hier folgt die Aufzählung der geprüf­ten Testkits, nach­fol­gend die Methode der Prüfung durch das CDC:]
    "Ein vor­läu­fi­ger LoD für jeden Assay wur­de bestimmt, indem drei­fa­che Proben der mit jeder Extraktionsmethode gerei­nig­ten RNA gete­stet wur­den. Extraktionsmethode auf­ge­r­ei­nigt wur­den. Der unge­fäh­re LoD wur­de durch Extraktion und Testen von 10-fachen Verdünnungsreihen von cha­rak­te­ri­sier­ten Beständen von in vitro tran­skri­bier­ter RNA in vol­ler Länge. Eine Bestätigung der LoD wur­de bestimmt wur­de durch die Verwendung von RNA-Proben in 3‑facher Verdünnungsserie mit 20 extra­hier­ten Replikaten ermit­telt. Der LoD wur­de bestimmt als die nied­rig­ste Konzentration, bei der ≥ 95% (19/20) der Replikate posi­tiv waren."

    2. Seite 39 – Limitations

    "Alle Benutzer, Analytiker und alle Personen, die Diagnoseergebnisse mel­den, soll­ten in der Durchführung die­ses Verfahren durch einen kom­pe­ten­ten Ausbilder geschult wer­den. Sie soll­ten ihre Fähigkeit zur Durchführung des Tests demon­strie­ren und die Ergebnisse zu inter­pre­tie­ren, bevor sie den Assay eigen­stän­dig durchführen.
    ***- Die Leistung des CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel zeigt sich nur in Proben der obe­ren und unte­ren Atemwege (wie z. B. nas­opha­ryn­gea­le oder oro­pha­ryn­gea­le Abstriche, Sputum, Aspirate der unte­ren Atemwege, bron­cho­alveo­lä­re Lavage und nas­opha­ryn­gea­le nas­opha­ryn­gea­lem Wasch-/Aspirat oder nasa­lem Aspirat).***
    – Negative Ergebnisse schlie­ßen eine 2019-nCoV-Infektion nicht aus und soll­ten nicht als allei­ni­ge Grundlage für für die Behandlung oder ande­re Entscheidungen zum Patientenmanagement ver­wen­det werden.
    ***Optimale Probentypen und Zeitpunkt für Virusspitzenwerte bei durch 2019-nCoV ver­ur­sach­ten Infektionen sind noch nicht ermit­telt worden.***
    Entnahme von Proben (Typen und Zeitpunkte) von ein und dem­sel­ben Patienten kann not­wen­dig sein, um das Virus nachzuweisen.
    – Ein falsch-nega­ti­ves Ergebnis kann auf­tre­ten, wenn eine Probe
    *** unsach­ge­mäß ent­nom­men, trans­por­tiert oder behan­delt wird.*** Falsch-nega­ti­ve Ergebnisse kön­nen auch auf­tre­ten, wenn Amplifikationsinhibitoren in der Probe vor­han­den sind oder wenn eine unzu­rei­chen­de Anzahl von Organismen in der Probe vor­han­den ist.
    !!!***- Positive und nega­ti­ve prä­dik­ti­ve Werte sind stark von der Prävalenz abhän­gig. Falsch-nega­ti­ve Testergebnisse sind wahr­schein­li­cher, wenn die Prävalenz der Krankheit hoch ist. Falsch-posi­ti­ve Testergebnisse bei nied­ri­ger Prävalenz.***
    – Ein falsch-nega­ti­ves Ergebnis kann auf­tre­ten, wenn eine Probe unsach­ge­mäß ent­nom­men, trans­por­tiert oder behan­delt wird. Falsch-nega­ti­ve Ergebnisse kön­nen auch auf­tre­ten, wenn Amplifikationsinhibitoren in der Probe vor­han­den sind oder
    ***wenn eine unzu­rei­chen­de Anzahl von Organismen in der Probe vor­han­den ist.***
    – Positive und nega­ti­ve prä­dik­ti­ve Werte sind stark von der Prävalenz abhän­gig. Falsch-nega­ti­ve Testergebnisse Ergebnisse sind wahr­schein­li­cher, wenn die Prävalenz der Krankheit hoch ist. Falsch-posi­ti­ve Testergebnisse sind wahr­schein­li­cher, wenn die Prävalenz mäßig bis gering ist.
    – Verwenden Sie kei­ne Reagenzien nach Ablauf des Verfallsdatums.
    – Wenn das Virus in der rRT-PCR-Zielregion mutiert, wird 2019-nCoV mög­li­cher­wei­se nicht oder weni­ger vor­her­sag­bar nach­ge­wie­sen wer­den. Inhibitoren oder ande­re Arten von Interferenzen kön­nen zu einem falsch-nega­ti­ven Ergebnis füh­ren. Eine Interferenzstudie zur Bewertung der Wirkung von Erkältungsmedikamenten wur­de nicht wur­de nicht durchgeführt.
    – Die Testleistung kann beein­träch­tigt wer­den, weil die Epidemiologie und das kli­ni­sche Spektrum der durch 2019-nCoV ver­ur­sach­ten Infektion nicht voll­stän­dig bekannt sind. Beispielsweise wis­sen Kliniker und Labore mög­li­cher­wei­se nicht, wel­che Arten von Proben opti­mal zu ent­neh­men sind und wann die­se Proben im Verlauf der Infektion am ehe­sten Mengen an vira­ler RNA ent­hal­ten, die leicht nach­ge­wie­sen wer­den können.
    !!!***- Der Nachweis von vira­ler RNA muss nicht unbe­dingt auf das Vorhandensein eines infek­tiö­sen Virus hin­wei­sen oder dar­auf, dass 2019-nCoV der Erreger der kli­ni­schen Symptome ist.***
    ***- Die Leistungsfähigkeit die­ses Tests wur­de nicht für die Überwachung der Behandlung einer 2019-nCoV Infektion.***
    ***- Die Leistung die­ses Tests wur­de nicht für das Screening von Blut oder Blutprodukten auf das Vorhandensein von 2019-nCoV.***
    ***- Dieser Test kann Krankheiten, die durch ande­re bak­te­ri­el­le oder vira­le Erreger ver­ur­sacht wer­den, nicht ausschließen. ***

    *** = durch mich als Markierung verwendet.
    Übersetzung mit deepL

    Markant sind m.E. die mas­si­ven Unsicherheiten. Beginnend damit, dass man "etwas" sucht, von dem man meint, es wäre dem Virus ähn­lich (das man nicht kennt), wer­den Prüfungen vor­ge­nom­men. Der Disclaimer unter 2. ver­weist dar­auf, was dabei alles schief­ge­hen kann. Richtig auch der Hinweis auf die Bedeutung der Prävalenz für die Aussagekraft und vor allem die Tatsache, dass der "Nachweis von vira­ler RNA muss nicht unbe­dingt auf das Vorhandensein eines infek­tiö­sen Virus hin­wei­sen oder dar­auf, dass 2019-nCoV der Erreger der kli­ni­schen Symptome ist.". 

    Also das, was Yeaden, Kämmerer, Füllmich, Wodarg etc. schon die gan­ze Zeit AUCH sagen.

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